Informatieve toelichtingen op onderdelen van de inschalingsartikelen (deel I en II) van bijlage 5 voor activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen.

1. Gene drives

1. Gene drives

Inschalingsartikel 5.0 voor activiteiten met een sequentie specifiek endonuclease die kunnen leiden tot een gene drive

 

Wat wordt bedoeld met een sequentie-specifiek endonuclease?

Endonucleases knippen onder meer dubbelstrengs DNA (dsDNA). Een voorbeeld van een sequentie-specifiek endonuclease is CRISPR/Cas9. Het Cas9 endonuclease wordt door een gids-RNA naar een specifieke locatie in het genoom geloodst om daar het dsDNA te knippen. De specificiteit voor de knipplaats wordt bepaald door het ‘gids-RNA’.
Andere voorbeelden van sequentie-specifieke endonucleases zijn Zn-finger nucleases en TALENs. In deze endonucleases wordt de knipplaats bepaald door een specifiek eiwitdomein dat veel arbeidsintensiever is om aan te passen dan het gids-RNA van CRISPR/Cas9. Maar ook deze endonucleases kunnen in principe toegepast worden als gene drive.

Wat is een gene drive?

Een gene drive is een genetisch element dat zich in een populatie kan verspreiden met een frequentie die hoger ligt dan de 50% die normaliter bij een Mendeliaanse overerving wordt gevonden. Deze verhoogde frequentie van overerving vindt plaats doordat de gene drive zichzelf kan kopiëren vanaf het ene chromosoom naar het andere zusterchromosoom. Na geslachtelijke voortplanting ontvangen alle nakomelingen een chromosoom met de gene drive. Ook in het genoom van de nakomelingen kan de gene drive zichzelf weer kopiëren naar het zusterchromosoom, waarna alle nakomelingen van de volgende generatie ook de gene drive zullen bevatten. Dit in tegenstelling tot een ‘normale’ (Mendeliaanse) overerving waarbij na elke generatie het percentage nakomelingen met een nieuw ingebrachte eigenschap steeds kleiner wordt. Als de nieuwe eigenschap met een gene drive wordt ingebracht, verspreidt deze eigenschap zich binnen een aantal generaties over de hele populatie.

Hoe werkt een gene drive?

Een gene drive bestaat uit sequenties die coderen voor een sequentie-specifiek endonuclease, zoals CRISPR/Cas9, die geflankeerd worden door DNA sequenties die homoloog zijn aan de sequentie rond de knipplaats van het Cas9 in het gastheer genoom (de zgn. gastheer-eigen homologe sequenties). De endonuclease werking van Cas9 zorgt voor een dubbelstrengs breuk in het gastheer DNA, die vervolgens kan worden gerepareerd door een cel-eigen reparatieproces dat homologe recombinatie wordt genoemd. Dit herstelproces heeft tot gevolg dat CRISPR/Cas9 in het chromosoom worden gekopieerd rond de knipplaats van het Cas9.
Vanaf dit chromosoom dat nu de gene drive bezit, wordt het endonuclease opnieuw actief waarbij het op de overeenkomstige locatie in het zusterchromosoom knipt. Ook hier zorgt het reparatie proces van homologe recombinatie er weer voor dat de breuk gedicht wordt waarbij de gene drive sequentie mee gekopieerd wordt. Door deze stap is de gene drive ook in het tweede chromosoom gekopieerd.
Een gedetailleerde uitleg van dit werkingsmechanisme is ook terug te lezen in bijvoorbeeld de publicatie van Gantz en Bier (Science 348(2015): 442-4).

Is een gene drive in elk organisme werkzaam?

Het RIVM beleidsrapport 'Gene drives' uit 2015 benoemt een drietal voorwaarden waarin een gene drive effectief is, namelijk in organismen die zich geslachtelijk kunnen voortplanten, die een korte generatietijd hebben en die een efficiënt proces van homologe recombinatie hebben. In de literatuur is de werking van een gene drive al beschreven voor fruitvliegjes, muggen en gistcellen.

Waarom inschaling op niveau IV?

Zorgwekkende eigenschappen van een gene drive zijn dat deze een effect kan hebben op populatie niveau en mogelijk irreversibel is. Organismen met een gene drive (in het kort gdo's) kunnen daarom mogelijk grote effecten hebben op het milieu die om een zorgvuldige afweging vragen voordat deze kunnen worden toegepast.
Om te voorkomen dat een gene drive bij ingeperkt gebruik wordt toegepast zonder dat is vastgesteld en gewaarborgd dat de risico’s van die toepassing verwaarloosbaar klein zijn, is ervoor gekozen een gene drive toepassing in beginsel in het strengste inperkingsniveau te plaatsen. Daarbij wordt de mogelijkheid open gelaten om een minder streng inperkingsniveau aan te vragen via een artikel 2.8 verzoek. In dit verzoek beschrijft u welke werkzaamheden u gaat uitvoeren en onder welke voorwaarden u dit wilt gaan doen. U levert daarbij een risicobeoordeling waarin u onderbouwt welke mogelijke risico’s op welke wijze worden ingeperkt om bij toepassing van een organisme met een gene drive het risico voor mens en milieu als verwaarloosbaar klein te kunnen beschouwen.  Bureau GGO beoordeelt de veiligheid van deze werkzaamheden en zal al dan niet instemmen met uw verzoek.

Waar vindt u informatie voor het uitvoeren van de risicobeoordeling?

Bijlage 8 van de Regeling ggo geeft een handreiking voor het maken van een risicobeoordeling. Hierbij worden in stap 1 de eigenschappen van de gastheer, de vector en de donorsequentie nader bepaald. In stap 2 worden de activiteiten in kaart gebracht. Aan het einde van stap 2 kunt u het indicatief inperkingsniveau voor het gdo bepalen. Hierbij kunt u gebruik maken van de volgende risicoklassen voor het organisme met een gene drive (het gdo):

  • gdo risicoklasse 1 (inperkingsniveau I): activiteiten met een gdo leiden tot een verwaarloosbaar klein of laag risico voor mens en milieu. Een gdo dat tot deze klasse behoort is in feite een ggo waarbij de verspreiding van een gene drive niet mogelijk is. Denk hierbij aan een gdo dat in het omliggende milieu niet kan overleven.
  • gdo risicoklasse 2 (inperkingsniveau II): activiteiten met een gdo hebben een gemiddeld risico. Hierbij moet gedacht worden aan een activiteit met een gdo dat geen permanent, maar een kortstondig schadelijk effect kan veroorzaken voor mens en milieu. Of indien de oorspronkelijke situatie hersteld kan worden door bijvoorbeeld het omliggende milieu met insecticiden te bespuiten. In geval van een kortstondig risico kan bijvoorbeeld gedacht worden aan een ‘daisy gene drive’, waarbij slechts enkele generaties nakomelingen de gene drive zullen erven.
  • gdo risicoklasse 3 (inperkingsniveau III): activiteiten met een gdo hebben een hoog risico. In dat geval bestaat de kans dat het gdo een permanent schadelijk effect kan veroorzaken door vestiging in het milieu en/of verspreiding van de gene drive aan nakomelingen.

Indien er sprake is van pathogeniteit van een gdo, dan dient u de schadelijke effecten ten gevolge van de pathogeniteit ook mee wegen. Hierdoor kan het inperkingsniveau dat op basis van de gdo risicoklasse is vastgesteld mogelijk lager of hoger worden.
In Hoofdstuk 4 van het RIVM rapport 2018  en in Applied Biosafety vindt u een toelichting op de risicobeoordeling en zijn voorbeelden gegeven.

Hoe stelt u vast welke inperkingsmaatregelen nodig zijn?

Voor het vaststellen van adequate inperkingsmaatregelen kunt u gebruik maken van de tabel met minimale inperkingsmaatregelen voor de verschillende gdo klassen die opgenomen is in Bijlage 2 van het RIVM rapport 2018 . De inperkingsmaatregelen die volgen uit deze gdo klasse legt u naast de standaardvoorschriften voor de verschillende categorieën van fysische inperking (CFI’s) zoals die zijn opgenomen in bijlage 9 van de Regeling ggo en u bepaalt welke CFI het meest overeenkomt met de benodigde gdo klasse. Voor de  voorschriften die aanvullend of vervangend zijn op de standaard voorschriften van Bijlage 9 kunt u een ATV verzoek indienen.

Wat is het verschil tussen genome editing met CRISPR/Cas9 en een gene drive?

Veruit de meeste toepassingen van CRISPR/Cas9 betreffen genome (gene) editing. Hierbij wordt CRISPR/Cas9 doorgaans tijdelijk een cel binnengebracht om via een knip in het genoom een mutatie te introduceren. Alleen de mutatie wordt aan de dochtercellen doorgegeven.
CRISPR/Cas9 krijgt de gene drive functionaliteit alleen indien het integreert in of nabij zijn knipplaats. Dit wordt bijvoorbeeld bewerkstelligd door de aanwezigheid van sequenties die homoloog zijn aan de gastheer eigen sequenties rond de knipplaats waardoor integratie van CRISPR/Cas9 in het gastheergenoom mogelijk is via homologe recombinatie. Het is van belang dat de gebruiker van het CRISPR/Cas9 systeem goed op de hoogte is van het verschil tussen het gebruik van CRISPR/Cas9 als genome editing systeem en het gebruik als gene drive. Reguliere genome editing technieken kunnen via de overige inschalingsartikelen van bijlage 5 worden ingeschaald.

Werkzaamheden met CRISPR/Cas9 die niet onder inschalingsartikel 5.0 beoordeeld hoeven te worden

Er wordt veelvuldig gebruik gemaakt van CRISPR/Cas9. Het is niet zo dat alle activiteiten met CRISPR/Cas9 onder inschalingsartikel 5.0 beoordeeld moeten worden. Activiteiten die er bijvoorbeeld niet onder vallen zijn:

  • transductie van animale cellen (zolang dit geen embryonale stamcellen betreffen) met een retrovirale vector waar op de sequenties coderend voor CRISPR/Cas9 gelegen zijn. Hoewel deze modificatie van de cellen tot integratie van de vector en dus van CRISPR/Cas9 in het gastheergenoom zal leiden, is een gene drive effect uit te sluiten omdat deze cellen geen geslachtelijke voortplanting kunnen ondergaan.
  • toediening van CRISPR/Cas9 in de vorm van eiwit respectievelijk RNA. Omdat geen CRISPR/Cas9 coderende sequenties aan de gastheercel aangeboden worden, is integratie van CRISPR/Cas9 in het genoom niet mogelijk en kan er geen sprake zijn van een gene drive.
2. Schadelijk genproduct

2. Schadelijk genproduct

Definitie schadelijk genproduct

De Regeling ggo geeft onder artikel 2 de volgende definitie voor een schadelijk genproduct:

  • een genproduct dat een mogelijk toxische, carcinogene, allergene, pathogene of immuun-modulerende eigenschap heeft, dan wel
  • een genproduct dat kan bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal, dan wel
  • een genproduct dat tot een antibioticumresistentie kan leiden waardoor de toepassing van medicijnen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar wordt gebracht.

 

Risicobeoordeling van een potentieel schadelijk genproduct

Stap 1: mogelijke schadelijkheid van sequentie vaststellen

De functie van het genproduct en de (potentiele) schadelijkheid van het product moeten omschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

 

Stap 2: werkzaamheid in nieuwe gastheer vaststellen

Indien een potentieel schadelijke sequentie gekloneerd wordt in een gastheer geldt in principe, ervan uitgaande dat het schadelijke genproduct aanwezig is en werkzaam kan zijn in de gastheer, minimaal een ML-II-k inschaling. Het daadwerkelijk schadelijke effect moet echter nog bepaald worden en is onder andere afhankelijk van de genetische en fysiologische context van de gastheer waarin de sequentie wordt toegepast.

Factoren die behulpzaam kunnen zijn bij het vaststellen of een potentieel schadelijk genproduct in de context van de gastheer ook als schadelijk beoordeeld moet worden, zijn bijvoorbeeld:

  • Herkomst van de sequentie. Het maakt uit of een sequentie afkomstig is van een pathogeen dan wel apathogeen micro-organisme of een hoger organisme. Een apathogeen micro-organisme zal over het algemeen geen schadelijke sequenties bevatten. Terwijl bij het kloneren van sequenties uit een pathogeen micro-organisme altijd rekening gehouden moet worden met de aanwezigheid van schadelijke genproducten. Ook bij het kloneren van sequenties uit bepaalde hogere organismen, zoals een wesp of een kwal, moet er rekening gehouden worden met de aanwezigheid van schadelijke sequenties.
  • De werkzaamheid van het genproduct in de fysiologische achtergrond van de gastheer. Bijvoorbeeld een virulentiefactor afkomstig uit een bepaalde pathogene bacterie zal alleen maar kunnen bijdragen aan de pathogene eigenschappen van de gastheer als de virulentiefactor past in het ‘leefpatroon’ van de gastheer. Of als een genproduct onderdeel is van een pathway, die leidt tot een schadelijk genproduct, dan moeten alle onderdelen van de pathway in het ggo aanwezig zijn om het schadelijke effect gerealiseerd te krijgen.
  • De omstandigheden van de expressie van het genproduct. Bijvoorbeeld, voor een genproduct dat van nature weefselspecifiek tot expressie komt, kan het een groot verschil maken wanneer het tot expressie wordt gebracht onder controle van een promoter die in alle weefsels actief is. Voor een genproduct dat normaliter getimed of na inductie tot expressie komt kan het verschil maken of het onder controle staat van een constitutieve (continue aangeschakelde) promoter. Voor een genomische DNA sequentie afkomstig uit een eukaryoot donororganisme, waarin intronen aanwezig zijn, maakt het uit of de gastheer een prokaryoot of een eukaryoot is. In een prokaryote gastheer zal de sequentie mogelijk niet tot expressie komen, omdat intron splicing in deze gastheer niet kan plaatsvinden.
  • De mate van expressie van het genproduct. De interpretatie van het risico van hoge expressie, of van onbalans van het natuurlijke expressie niveau, moet worden beoordeeld ten opzichte van het niveau van de expressie onder normale omstandigheden.
  • Posttranscriptionele of posttranslationele modificatie. Sommige genproducten krijgen hun fysiologische werking, en daarmee ook hun potentieel schadelijke werking, pas na posttranslationele modificatie, of nadat ze geleid zijn naar het juiste celcompartiment.
  • Interactie met subunits of cofactoren. Indien de schadelijke werking een samenspel is van subunits, is het van belang vast te stellen of deze subunits allen tesamen tot expressie worden gebracht en tot een schadelijk effect kunnen leiden.

 

Stap 3: schadelijkheid van het ggo voor mens en milieu vaststellen

Nadat is vastgesteld dat een schadelijk genproduct inderdaad werkzaam is in de context van de gastheer dient de schadelijkheid voor mens en milieu van het ggo nog bepaald te worden. Het effect van potentieel schadelijke genproducten kan namelijk ook beperkt zijn tot de gastheer, e.g. het genproduct heeft alleen een direct effect op de gastheer, maar is niet schadelijk voor mens of milieu. Bij het vaststellen van de schadelijkheid voor mens en milieu worden ook het verspreidingsrisico van het desbetreffende ggo en de mogelijke ernst van de effecten veroorzaakt door het schadelijke genproduct bij eventuele verspreiding meegewogen. Daarbij kan aangetekend worden dat deze stap in iedere risicoanalyse uitgevoerd moet worden, ook bij klonering van genproducten die niet onder de definitie van schadelijk genproduct vallen. Hoewel minder voor de hand liggend dan bij de toepassing van schadelijke genproducten kan niet op voorhand worden uitgesloten dat ook onschadelijke, of niet obligaat schadelijke genproducten de eigenschappen van een gastheer kunnen beïnvloeden, waardoor een schadelijk effect voor mens of milieu kan ontstaan.

Voorbeelden:

- Het tot expressie brengen van een toxine zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden vanwege het directe schadelijke effect, bijvoorbeeld het expresseren van een toxine in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II-k op grond van artikel 5.2.f. Indien men een van een toxine afgeleid deeltoxine tot expressie wil brengen, dan zijn er meerdere situaties denkbaar:

  • De aanvrager heeft geen beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is. Er moet in de risicobeoordeling nog steeds van uitgegaan worden dat sprake is van een schadelijk genproduct. Inschaling: ML-II-k op grond van artikel 5.2.f.
  • De aanvrager heeft de beschikking over experimentele gegevens, zoals bijvoorbeeld een LD50  waarde > 100 µg/kg, waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is voor vertebraten (zie de criteria COGEM voor toxines CGM/050628-01). Inschaling ML-I, op grond van artikel 5.2.i, aangezien het deeltoxine aantoonbaar niet codeert voor een schadelijk genproduct.
  • De aanvrager heeft niet de beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is, maar baseert dit op een theoretische onderbouwing. Inschaling ML-II-k op grond van artikel 5.2.f, waarbij men een 2.8 verzoek kan indienen voor inschaling op ML-I waarbij onderbouwd dient te worden dat dit deeltoxine geen schadelijke effecten heeft.

- Het tot expressie brengen van allergenen zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden, vanwege het directe schadelijke effect. Het expresseren van een allergeen in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II-k, op grond van artikel 5.2.f. Klonering van bepaalde allergenen in E. coli kan onder voorwaarden op ML-I plaatsvinden, bijvoorbeeld in de situatie dat het allergeen achter een induceerbare promoter gekloneerd is. In een dergelijk geval kan via een 2.8 verzoek om inschaling op ML-I niveau worden verzocht.

- De inschaling van oncogenen als schadelijk genproduct is sterk context-afhankelijk. Bij klonering in E. coli van een plasmide met een oncogen of bij transfectie van animale cellen met een oncogen bevattend plasmide, wordt het oncogen doorgaans als niet-schadelijk voor mens en milieu beschouwd, omdat het verspreidingsrisico van E. coli en animale cellen al zeer klein is en de kans dat hierdoor het schadelijke effect (tumorvorming) zal optreden verwaarloosbaar is, vanwege de verschillende stappen die voor tumorvorming (o.a. integratie van het oncogen in het genoom gevolgd door mutaties in andere oncogenen) nodig zijn. Dit betekent dus dat in deze context individuele oncogenen niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen (veelal) op ML-I kunnen worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i of 5.4.1.i. In de context van inschaling van pathogene micro-organismen, met name virussen, zal het potentieel schadelijke effect van het oncogen te allen tijde moeten worden meegewogen. Virussen hebben een groter verspreidingsrisico. Bovendien hebben oncogenen de potentie om de pathogeniteit van virussen te beïnvloeden. Klonering van oncogenen in virussen zal dus leiden tot een hogere standaard inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de oncogene donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

NB: Vele genetisch gemodificeerde cellijnen zijn geïmmortaliseerd met behulp van de immortaliserende eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A of hTERT. Cellijnen die op deze manier zijn geïmmortaliseerd en die vervaardigd zijn met behulp van een tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentiviraal systeem kunnen via artikel 5.4.2.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.2.i (in geval van hTERT) direct op ML-II-k worden ingeschaald. Ook geïmmortaliseerde cellijnen vervaardigd met behulp van virale systemen (de genoemde meervoudige plasmiden systemen) gebaseerd op muizenretrovirussen, AAV of humaan adenovirus kunnen via artikel 5.4.3.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.3.i (in geval van hTERT) direct op ML-II-k (zonder 2.8 verzoek) worden ingeschaald.

- Bij klonering in E. coli of bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen coderend voor een immuunmodulerend eiwit bevat, is het, evenals bij oncogenen, niet zeer waarschijnlijk dat hierdoor een blijvend schadelijk effect voor mens en milieu zal kunnen optreden. Dit betekent dus dat in deze context immuunmodulerende eiwitten niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen meestal op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.2.i of 5.4.1.i. In een andere context, bij de inschaling van pathogene micro-organismen, zal het potentieel schadelijke effect te allen tijde moeten worden meegewogen. Immuunmodulerende genen hebben de potentie om de virulentie/pathogeniteit van micro-organismen te beïnvloeden. Een bekend voorbeeld is het muizen IL-4 gen (een gen coderend voor een immuunmodulerend cytokine) dat bij klonering in een muizenpokkenvirus tot een verhoogde virulentie leidde. Klonering van immuunmodulerende eiwitten in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i) Indien afdoende is onderbouwd dat de immuunmodulerende donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek  teworden gedaan.

Pathogeniteitsfactoren. Bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen coderend voor een enkele pathogeniteitsfactor bevat, is het niet zeer waarschijnlijk dat hierdoor een schadelijk effect voor mens en milieu zal kunnen optreden. Dit betekent dus dat in deze context pathogeniteitsfactoren niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.4.1.i. Ook bij klonering in E. coli zal een individuele pathogeniteitsfactor, met name indien deze normaal gesproken deel uitmaakt van een pathway bestaande uit meerdere componenten, doorgaans niet tot een schadelijk effect kunnen leiden en kan deze via 5.2.i worden ingeschaald. Echter in geval van klonering van een individuele pathogeniteitsfactor die direct de apathogene eigenschappen van E. coli zou kunnen beïnvloeden (gedacht kan worden aan een individueel eiwit dat het tropisme van E. coli verandert of deze invasief maakt voor cellen) dient er via 5.2.f te worden ingeschaald. In de context van pathogene micro-organismen, zal het potentieel schadelijke effect te allen tijde moeten worden meegewogen. Klonering van pathogeniteitsfactoren in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de pathogeniteitsfactor in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

- Aggregerende eiwitten: een bijzondere categorie van schadelijke genproducten betreffen sequenties coderend voor aggregerende eiwitten met pathogene effecten zoals prionen, alpha-synucleine en tau.
Sequenties coderend voor prionen dienen te allen tijde als schadelijk genproduct te worden ingeschaald aangezien is aangetoond dat prionen infectieus en overdraagbaar zijn en een risico voor mens en milieu kunnen vormen.
Voor overige aggregerende eiwitten met (potentieel) pathogene effecten zoals alpha-synucleine,  amyloid‐β, tau, superoxide dismutase 1, huntingtin, TAR DNA‐binding protein‐43, serum amyloid A en apolipoprotein A‐II geldt dat er, anders dan bij prionen, tot op heden niet is aangetoond dat deze aggregerende eiwitten en de daarmee geassocieerde ziekten zich via een natuurlijke route van mens-op-mens kunnen verspreiden.
Echter, indien deze aggregerende eiwitten in combinatie met replicerende en zich verspreidende vectoren worden gebruikt kan verspreiding naar en blootstelling van derden aan een aggregerend eiwit met mogelijk sterk nadelige gevolgen niet worden uitgesloten. Daarom zullen in deze gevallen aanvullende inperkende maatregelen noodzakelijk zijn om de veiligheid van mens en milieu te waarborgen (zie ook CGM/170316-04).

De inschaling van sequenties coderend voor aggregerende eiwitten, uitgezonderd prionen, is derhalve context-afhankelijk:

  • Klonering in E. coli K12 en expressie in animale cellen van sequenties coderend voor prionen, inschaling ML-II-k, op grond van respectievelijk artikel 5.2.f en 5.4.1.f.
  • Klonering in E. coli K12 en expressie in animale cellen (zonder toepassing van virale vectoren) van sequenties coderend voor aggregerende eiwitten (uitgezonderd prionen), inschaling ML-I, op grond van respectievelijk artikel 5.2.i en 5.4.1.i.
  • Activiteiten met muizen en ratten transgeen voor prionen en met cellen en weefsels van deze dieren kunnen niet via bijlage 5 worden ingeschaald. Hiertoe dient een 2.8 verzoek te worden ingediend.
  • Activiteiten met muizen en ratten transgeen voor aggregerende eiwitten (uitgezonderd prionen) en met cellen en weefsels van deze dieren, inschaling respectievelijk D-I op grond van 5.6.1.a en ML-I op grond van 5.4.4.a.
  • Activiteiten waarbij sequenties coderend voor aggregerende eiwitten als donorsequentie in virale vectoren worden toegepast dienen via 5.4.2.f of 5.4.3.f te worden ingeschaald. Indien afdoende onderbouwd kan worden (bijvoorbeeld op grond van bestaande COGEM adviezen met soortgelijke virale vectoren en activiteiten) dat de donorsequentie in de context van de virale vector niet in een schadelijk effect resulteert kan direct via 5.4.2.f of 5.4.3.f op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling (ML-III dan wel ML-II-k) dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.
  • Voor activiteiten met andere gastheren (dan de hierboven genoemde) in combinatie met aggregerende eiwitten is het advies om eerst contact op te nemen met Bureau GGO over de te volgen inschaling en procedure.

NB: voor de activiteiten met sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die op het laagste inperkingsniveau mogen plaatsvinden geldt dat in het kader van de ggo-regelgeving geen aanvullende veiligheidsmaatregelen noodzakelijk zijn anders dan eventueel weergeven in deel II van Bijlage 5 van de Regeling GGO. Vanuit ARBOArbeidsomstandigheden-overwegingen moeten echter wel veiligheidsmaatregelen getroffen worden om laboratoriummedewerkers te beschermen, zoals vastgelegd in het Arbeidsomstandighedenbesluit. Dit is tevens het geval indien er geen sprake meer is van activiteiten met ggo’s, bijvoorbeeld na afdoding van de ggo’s, maar van werkzaamheden met (opgezuiverde) aggregerende eiwiten.

Antibioticumresistentiegenen kunnen schadelijk zijn voor mens of milieu indien de toepassing van medicijnen hierdoor in gevaar wordt gebracht. Dit is doorgaans niet het geval voor kleinschalige handelingen met veelvuldig in de moleculaire biologie toegepaste antibioticum resistentie genen zoals ampicilline (bla), kanamycine en neomycine (npt-I/II) resistentie genen. Deze kunnen bij toepassing in E. coli als onschadelijk worden beschouwd en op ML-I worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i. Toepassing van antibioticum resistentie genen die coderen voor resistentie tegen klinisch relevante middelen (zoals bijvoorbeeld ESBLs en vancomycine resistentie genen) leiden wel tot een hogere inschaling (ML-II-k of hoger), op grond van artikel 5.2.f.

- Genproducten die kunnen bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal zijn bijvoorbeeld zelfoverdraagbare genetische elementen en transposons. Hierbij kunnen de volgende veelvoorkomende situaties worden onderscheiden:

  • Bij klonering in E. coli K12 wordt een zelfoverdraagbaar genetisch element gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II-k op grond van artikel 5.2.f
  • Bij klonering in E. coli K12 wordt een actief (prokaryoot of eukaryoot) transposon waarbij zich tussen de transposon uiteinden gekloneerd materiaal bevindt gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II-k op grond van artikel 5.2.f
  • Dit geldt niet voor een inactief transposon, dat bijvoorbeeld zijn transposase heeft verloren. Inschaling bij klonering in E. coli K12, ML-I op grond van artikel 5.2.i
  • Er zijn geen aanwijzingen dat toepassing van zelfoverdraagbare elementen en transposons in een plasmide vector in eukaryote cellen tot horizontale overdracht van genetisch materiaal kan leiden. Inschaling, ML-I op grond van artikel 5.4.1.i
  • Klonering van een actief transposon in een pathogeen micro-organisme van klasse 2 kan op grond van artikel 5.3.f direct op ML-II-k plaatsvinden indien afdoende is onderbouwd dat het transposon in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert.

Ook genproducten die niet onder de definitie van een schadelijk genproduct vallen kunnen in een bepaalde context toch een schadelijk effect hebben. Hierbij kan gedacht worden aan sequenties en eiwitten die op zichzelf niet schadelijk zijn maar die wanneer geinsereerd in een micro-organisme het tropisme kunnen veranderen (in geval van virussen) of de invasiviteit voor animale cellen kunnen bevorderen (in geval van bacteriën) en daardoor in potentie de pathogeniteit kunnen beïnvloeden. Dergelijke sequenties kunnen bijvoorbeeld bij transfectie in animale cellen als niet schadelijk worden ingeschaald (ML-I, conform 5.4.1.i), terwijl deze in de context van een bacterie tot een hogere inschaling kunnen leiden (ML-II-k conform 5.2.f of ML-III conform 5.3.f). Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek te worden ingediend.

3. (On)gekarakteriseerde ds

3. (On)gekarakteriseerde ds

Gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties

Toelichting gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties

In de inschalingsartikelen van bijlage 5 wordt gesproken over gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties. In Bijlage 2, lijst A3 onder punt 1 wordt beschreven wanneer een sequentie in ieder geval als ongekarakteriseerd beschouwd moet worden.

Een sequentie wordt in ieder geval beschouwd als ongekarakteriseerd indien een of meerdere van de hierna genoemde gegevens ontbreken:

  1. de herkomst en de aard van de sequenties;
  2. de wijze waarop de insertie is geconstrueerd;
  3. een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben.

Aandachtspunten bij de onderbouwing bedoeld onder c, zijn de functie en de relatieve posities van

  • structurele genen,
  • regulerende sequenties,
  • synthetische sequenties,
  • van transposons en provirussen afgeleide sequenties en
  • sequenties die van belang zijn voor de replicatie in het genetisch gemodificeerde organisme.

a.     De herkomst en de aard van de sequenties

De herkomst, dus de donor waaruit de sequenties gekloneerd worden, moet bekend zijn en omschreven worden, ongeacht of het een hoger organisme of een micro-organisme betreft. Indien de donor een niet viraal (a)pathogeen (een bacterie, schimmel of parasiet) is, dan moet deze vermeld staan op bijlage 2, lijst A1 of op één van de lijsten van bijlage 4, lijst 4.2, 4.3 of 4.4. In geval van een viraal pathogeen moet deze vermeld staan op bijlage 4, lijst 4.1. Als het micro-organisme niet op één van de bijlagen vermeld staat, dan moet de gebruiker een artikel 2.8 verzoek doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen.
Verder moet de aard van de sequenties beschreven worden, hierbij gaat het om wat voor soort sequenties het betreft, is het bijvoorbeeld een genomische sequentie, een cDNA bank, een specifiek gen, een synthetische sequentie of een gedeelte van de coderende sequentie van een gen.

b.    de wijze waarop de insertie is geconstrueerd

De manier waarop de sequenties gekloneerd zijn of gaan worden moet omschreven worden, aangezien dit voor de inschaling bepalend kan zijn. Worden sequenties random gekloneerd uit bekende donoren of juist uit een pool van (on)bekende donoren? Wordt met aspecifieke primers gezocht of wordt met specifieke primers naar een specifiek gen gezocht en wordt uitsluitend dit specifieke gen gekloneerd? Worden uitsluitend korte sequenties (bijvoorbeeld domeinen of delen van genen) of ook langere sequenties (complete genen) gekloneerd?

c.     een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben

De functie(s) die een sequentie kan hebben, moet(en) beschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

Om in de risicobeoordeling een sequentie als gekarakteriseerd te kunnen beschouwen moet op nucleotide niveau vastgesteld zijn dat het daadwerkelijk de beoogde sequentie betreft en moet van deze sequentie beargumenteerd worden welke functie(s) de sequentie heeft. Het is dus van belang op te merken dat een fragment waarvan alleen de nucleotide sequentie is vastgesteld niet per definitie als gekarakteriseerd is te beschouwen. De gegevens over functie en herkomst moeten immers ook geleverd worden.

 

Vaststellen van de identiteit van een sequentie

Het vaststellen van de identiteit van de beoogde sequentie op nucleotide niveau kan op verschillende manieren uitgevoerd worden en is afhankelijk van het uitgangsmateriaal.

  • Wanneer er random gekloneerd wordt, is er in eerste instantie altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties en moet er ingeschaald worden via a t/m e, daarbij rekening houdend met eventuele aanwezigheid van potentieel schadelijke genproducten en de wijze van klonering.
  • Als er een cDNA bank gemaakt wordt in E. coli is er altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties. Vervolgens kan er op zoek gegaan worden naar specifieke sequenties waarvan de functie bekend is. Dit kan op verschillende manieren, afhankelijk van wat er al bekend is van de sequentie: met specifieke primers, door te sequencen, door restictie-enzym analyse, western blot of met functionele enzymatisch bepalingen. Indien de herkomst, aard en functie van het gekloneerde gen afdoende is bewezen is er sprake van een gekarakteriseerde sequentie en kan er ingeschaald worden volgens f t/m i.
  • Wanneer uit een pool van random sequenties een specifiek gen gekloneerd gaat worden, waarvan de sequentie en functie bekend zijn, kan met specifieke nested primers een specifiek PCR fragment gegenereerd worden. Nadat de identiteit van dat fragment met een gevalideerde methode bevestigd is, bijvoorbeeld door sequentie analyse of restrictie enzym analyse in combinatie met de grootte van het fragment, mag er van een gekarakteriseerde sequentie uitgegaan worden.
  • Indien een bekende sequentie van derden is verkregen, dan kan de identiteit van de sequentie (de reinheid) vastgesteld worden met behulp van restrictie-enzym analyse aangezien het hier een secondaire karakterisering betreft.

Voorbeelden:

  1. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis (klasse 3) waarbij complete genen zijn geamplificeerd middels RT-PCR. Inschaling ML-II-k via 5.2.a.
  2. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis waarbij korte sequenties van ten hoogste 50 bp (doel: amplificatie van korte antigene en merker sequenties) worden gekloneerd. Inschaling ML-II-k via 5.2.d aangezien door de beperkte grootte van de fragmenten er geen schadelijke genproducten gekloneerd zullen worden. Via een 2.8 verzoek kan om lagere inschaling worden gevraagd. Hierbij dient een onderbouwing geleverd te worden waarbij bijvoorbeeld de gevolgde wijze van klonering en eventueel gevolgde karakterisatie stappen betrokken worden. 
  3. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij antibioticumresistentie tegen klinisch relevante middelen uit E. coli in Salmonella typhimurium (klasse 2), waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-III via 5.3.f.
  4. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij vetzuurmetabolisme (zonder schadelijke eigenschappen) uit Mycobacterium tuberculosis, in Salmonella typhimurium (klasse 2) waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-II-k via 5.3.i.

Hoe moet nu bij de risicobeoordeling omgegaan worden met gekarakteriseerde dan wel ongekarakteriseerde sequenties in combinatie met een potentieel schadelijk genproduct?

In de inschalingsartikelen van bijlage 5, onder 5.2 t/m 5.4.3 is er voor de inschaling van alle activiteiten een onderverdeling gemaakt in gekarakteriseerde sequenties (f t/m i) en ongekarakteriseerde sequenties (a t/m e).

 

Gekarakteriseerde sequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen f t/m i is er sprake van activiteiten met gekarakteriseerde sequenties en zijn de eigenschappen van de sequentie bepalend voor de inschaling. Als het virale sequenties betreft wordt ingeschaald onder g of h (NB. enkelvoudige virale sequenties kunnen indien voldoende gekarakteriseerd onder 5.2, 5.3 en 5.4.1 ook onder i. worden ingeschaald). Zijn het niet-virale, potentieel schadelijke sequenties afkomstig van micro-organismen of hogere organismen dan moet ingeschaald worden volgens f. Als de sequenties voldoen aan de criteria van bijlage 2, lijst A3 en dus onschadelijk zijn, dan kan er ingeschaald worden via i.

 

Ongekarakteriseerde donorsequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen a t/m e is er sprake van activiteiten met ongekarakteriseerde sequenties die afkomstig zijn van een donor of van verschillende donoren waarbij de aard en de functie van de sequenties nog niet bepaald is. Daarmee zijn de eigenschappen van de donor bepalend voor de inschaling.

Het is bekend dat veel niet-virale pathogenen schadelijke sequenties bevatten. In dat geval dient er voor ongekarakteriseerde sequenties ingeschaald te worden volgens a, aangezien niet uitgesloten kan worden dat het mogelijk een schadelijk genproduct betreft. Indien door de werkwijze uitgesloten wordt dat schadelijke sequenties gekloneerd worden uit niet-virale pathogenen van klasse 2 of 3 die al dan niet schadelijke sequenties bevatten, dan kan ingeschaald worden volgens d.

Als deze sequenties afkomstig zijn van virale donoren dan dient ingeschaald te worden onder b (in geval van een voor eukaryote cellen infectieus virus) of c (in geval van een defect, voor eukaryote cellen infectieus virus). In het geval van virale sequenties is de classificatie van het virus waaruit de sequentie afkomstig is bepalend voor de inschaling van de sequentie. Indien het om een onbekend of niet geclassificeerd virus gaat, dient men altijd een artikel 2.8 verzoek te doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen. 

Als de donor een hoger organisme is en geen schadelijke genproducten bevat, dan kan via e ingeschaald worden. Echter, ook bij hogere organismen kan niet in alle gevallen uitgesloten worden dat er toch schadelijke genproducten aanwezig zijn en gekloneerd worden. Dit is met name het geval bij verrijking van (potentieel) schadelijke sequenties gedurende het kloneringsproces. In een dergelijk geval bestaat de mogelijkheid dat bij ongekarakteriseerde sequenties van hogere organismen toch via a moet worden ingeschaald.

Voorbeelden:

  1. Wanneer een genomische of cDNA bank van land- en tuinbouwgewassen gekloneerd wordt in E. coli K12 dan kan via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald. Land- en tuinbouwgewassen worden beschouwd als veilig, hoewel het bekend is dat ze wel toxische stoffen kunnen bevatten, maar die zijn het resultaat van een hele reeks van genen die onderdeel zijn van een pathway. Alleen wanneer het doel van de experimenten is om de complete pathway te kloneren en tot expressie te brengen in een nieuwe gastheer moet er via 5.2.a op ML-II-k ingeschaald worden.
  2. Ook genomische of cDNA banken van zoogdieren of de mens welke gekloneerd worden in E. coli K12 kunnen via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald, ondanks dat het DNA mogelijk transposons, sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die geassocieerd zijn met pathogene effecten (zoals bv. prionen) of virale sequenties bevat. Alleen als men dit soort genen actief opzoekt dan wel gaat verrijken, dient er te worden ingeschaald via 5.2.a op ML-II-k uitgaande van de (potentiële) schadelijkheid van deze genproducten of via 5.2.b. of 5.2.c. in geval van virale sequenties.
  3. Wanneer een genomische of cDNA bank van micro-organismen die voorkomen in grondmonsters gekloneerd wordt in E. coli K12 dan moet er vanuit gegaan worden dat een mengsel van al het genetisch materiaal van de potentieel aanwezige micro-organismen in de grond gekloneerd wordt. In de grond komen namelijk ook pathogene micro-organismen voor die schadelijke sequenties bevatten. Daarom moet er bij de risicobeoordeling van uitgegaan worden dat iedere sequentie van alle aanwezige micro-organismen gekloneerd kan zijn en dus wordt bij de risicobeoordeling ingeschaald volgens inschalingsartikel 5.2.a ‘de donor bevat een schadelijk genproduct dat werkzaam kan zijn in de gastheer’.

Bovenstaande voorbeelden zijn van toepassing op artikel 5.2. Voor de inschaling van ongekarakteriseerde sequenties via 5.3 en 5.4 kunnen veelal soortgelijke redeneringen toegepast worden. Er dient bij de inschaling echter altijd rekening gehouden te worden met de context van het ggo waarin het genproduct gekloneerd wordt. Ter illustratie: een genproduct coderend voor een immuunmodulerend eiwit dat onschadelijk is bij klonering in een apathogene E. coli K12 stam zou in de context van een ander ggo, bijvoorbeeld een pathogeen virus of een pathogene bacterie, wel degelijk schadelijk kunnen zijn. In dat geval wordt dus hetzelfde genproduct als onschadelijk beschouwd bij inschaling via 5.2 en als schadelijk beschouwd bij inschaling via 5.3 of 5.4.

4. Virale seq: 5.2, 5.3, 5.4.1

4. Virale seq: 5.2, 5.3, 5.4.1

Virale sequenties bij inschalingsartikel 5.2, 5.3 en 5.4.1: infectieus virus, defect virus en enkele virale sequenties

In een defect virus zijn één of meerdere genen of regulatoire sequenties niet langer functioneel, of gedeleteerd, waardoor het virus een factor mist die nodig is voor het doorlopen van de complete virale levenscyclus. Het virus kan wel repliceren in animale cellen die voorzien in die factor, de ‘helperfunctie’. Virale sequenties kunnen, afhankelijk van de “compleetheid” van het virale genoom, ingeschaald worden als donorsequentie onder b/g, c/h of e/i:

b/g: er zijn virale sequenties aanwezig die kunnen leiden tot de vorming van een voor eukaryote cellen infectieus virus dan wel de vorming van virale replicons

Voorbeelden:

  • volledig genoom van een virus;
  • genoom van een deletiemutant waarin een niet essentieel gen gedeleteerd is;
  • sequentie coderend voor replicon systeem gebaseerd op een enkel genoomsegment.

 

c/h: hieronder dienen vectoren die virale sequenties bevatten die kunnen leiden tot de vorming van een defect, voor eukaryote cellen infectieus virus ingeschaald te worden. Ook vectoren die virale replicatiesignalen en packagingsignalen bevatten, zoals volledige genoomsegmenten en virale transfervectoren, dienen hieronder ingeschaald te worden.

Voorbeelden:

  • enkel genoomsegment van gesegmenteerd virus;
  • genoom van een deletiemutant waarin een essentieel gen gedeleteerd is;
  • genoom van een niet-gesegmenteerd virus gedeleteerd voor de 5’ en 3’ NTRs;
  • open reading frame (ORF) van een virus dat slechts 1 ORF bevat;
  • sequentie coderend voor enkel genoomsegment van een replicon systeem gebaseerd op meerdere genoomsegmenten;
  • virale transfervector (lentivirus, retrovirus, AAV).

 

e/i: er zijn virale sequenties aanwezig die coderen voor een enkel viraal genproduct of regulatoire sequentie en deze sequenties vallen niet onder de definitie van schadelijk genproduct.

LET OP: indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één ORF bevat, dan dient dit ORF als defect, voor eukaryote cellen infectieus virus ingeschaald te worden onder c of h.

Voorbeelden:

  • CMV promoter
  • SV40 promoter (SV40 ori is hierin aanwezig)
  • gen coderend voor VSV-G eiwit

NB: Indien in de virale vector een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct kan een hogere inschaling van toepassing zijn.

5. Virus van klasse 4, 3 of 2

5. Virus van klasse 4, 3 of 2

Inschalingslid b, c, g en h: virus van klasse 4, 3 of 2

Om inschalingslid b, c, g of h van toepassing te laten zijn, moet het virus benoemd zijn op de lijst 4.1 van Bijlage 4 van de Regeling. Deze lijst bevat de classificatie van virussen op basis van hun ziekteverwekkend vermogen voor mens en/of dier.

Indien het virus niet op deze lijst voorkomt dan moet een risicobeoordeling overeenkomstig bijlage 8 van de Regeling uitgevoerd worden en een artikel 2.8. verzoek worden gedaan om de pathogeniteitsklasse van het virus vast te stellen. Bij deze risicobeoordeling dient aangegeven te worden, met gebruikmaking van de definities van de klassen van micro-organismen, tot welke klasse het betreffende virus behoort.

6. niet-viraal pathogeen

6. niet-viraal pathogeen

Inschalingslid d: niet-viraal pathogeen van klasse 4, 3 of 2

Om inschalingslid d van toepassing te laten zijn, moet het pathogeen benoemd zijn op één van de lijsten 4.2, 4.3 of 4.4 van Bijlage 4 van de Regeling. Deze lijsten bevatten de classificatie van pathogene bacteriën (4.2), schimmels (4.3) en parasieten (4.4) op basis van hun ziekteverwekkend vermogen voor mens en/of dier.

Indien het pathogeen niet op deze lijst voorkomt moet een risicobeoordeling overeenkomstig bijlage 8 van de Regeling uitgevoerd worden en een artikel 2.8 verzoek worden gedaan om de pathogeniteitsklasse van het pathogeen vast te stellen. Bij deze risicobeoordeling dient aangegeven te worden, met gebruikmaking van de definities van de klassen van micro-organismen, tot welke klasse het betreffende pathogeen behoort.

7. Inschalingsartikel 5.2 (1)

7. Inschalingsartikel 5.2 (1)

Inschalingsartikel 5.2: De samenstellende delen behoren niet tot de groep van inserties zoals bedoeld in bijlage 2 lijst A3. Indien dit wel het geval is dienen die delen beschouwd te worden als donorsequenties

Alle onderdelen van de vector moeten in de risicobeoordeling meegenomen worden om uit te sluiten dat er potentieel schadelijke genproducten of virale sequenties (waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren) in de vector aanwezig zijn. Indien één van de samenstellende delen van deze vector behoort tot de groep van inserties zoals beschreven in bijlage 2 lijst A3, dan mag dit samenstellende deel niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moet deze beoordeeld worden als donorsequentie.

Voorbeeld: een sequentie coderend voor een enzymatische functie betrokken bij transpositie moet beschouwd worden als donorsequentie, en zal, afhankelijk van de context van het ggo, mogelijk gezien worden als schadelijk genproduct.

8. Inschalingsartikel 5.2 (2)

8. Inschalingsartikel 5.2 (2)

Inschalingsartikel 5.2: De vector bevat geen virale sequenties, afkomstig van virussen die hogere eukaryoten als gastheer hebben, waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren. Indien dit wel het geval is, dienen die sequenties beschouwd te worden als donorsequenties

Indien in de vector virale sequenties aanwezig zijn die kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte, voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels, dan mogen deze virale sequenties niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moeten deze beoordeeld worden als donorsequenties. Afhankelijk van de karakterisatie en het al dan niet defect zijn van de virale vector volgt een inschaling volgens 5.2, onder b, c, g of h.

Het aanwezig zijn van virale sequenties die coderen voor een enkel viraal genproduct* of regulatoire sequentie, bijvoorbeeld de aanwezigheid van een CMV promoter, SV40 polyA sequentie, IRES sequentie of het gen coderend voor het VSV-G eiwit, in de vector backbone is toegestaan, omdat dergelijke sequenties op zich niet kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels. Zodoende mogen deze sequenties wel beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone. Wel moeten deze virale sequenties meegenomen worden in de risicobeoordeling indien de vector wordt toegevoegd via bijvoorbeeld transfectie of transductie aan animale cellen die virale sequenties bevatten. In dat geval vindt inschaling plaats via 5.4.2 of 5.4.3.

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als donorsequentie beoordeeld te worden.

9. Lijst A3

9. Lijst A3

Lijst A3: Inserties behorende bij combinatie A uit bijlage 2

Lijst A3 met inserties die een sequentie bevat die het in te brengen genetisch materiaal niet mag bevatten om te voldoen aan combinatie A.

Inserties die één of meer van de onderstaande sequenties bevatten:

1. Ongekarakteriseerde sequenties:

Een sequentie wordt in ieder geval beschouwd als ongekarakteriseerd indien een of meerdere van de hierna genoemde gegevens ontbreken:

  • de herkomst en de aard van de sequenties;
  • de wijze waarop de insertie is geconstrueerd;
  • een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben.

Aandachtspunten bij de onderbouwing bedoeld onder c, zijn de functie en de relatieve posities van structurele genen, regulerende sequenties, synthetische sequenties, van transposons en provirussen afgeleide sequenties en sequenties die van belang zijn voor de replicatie in het genetisch gemodificeerde organisme.

2.   Sequenties coderend voor:

  • toxines en cytolysines met een LD50 voor vertebraten van 100 microgram of minder per kilogram lichaamsgewicht;
  • overige virulentie- en pathogeniteitsfactoren;
  • virale en cellulaire oncogenen in combinatie met een virale vector die virale sequenties bevat die betrokken zijn bij integratie of replicatie;
  • enzymatische functies die betrokken zijn bij transpositie of integratie van transposons of provirussequenties;
  • functies die leiden tot zelfstandige overdracht van genetisch materiaal;
  • functies waardoor de insertie als virale vector kan functioneren;
  • een antibioticumresistentie die van nature niet voorkomt in de soort waartoe de gastheer behoort, of in aanverwante soorten, indien daardoor de toepassing van medicijnen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar wordt gebracht.
10. Lijst donororganismen

10. Lijst van donororganismen

Lijst van donororganismen die geen schadelijke genproducten bevatten

De volgende donor organismen kunnen bij de inschaling volgens bijlage 5, artikel 5.2: activiteiten met a-pathogene gastheren, worden beschouwd als donor organismen die geen schadelijk genproduct bevatten, ondanks dat het DNA mogelijk transposons, sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die geassocieerd zijn met pathogene effecten (zoals bv. prionen) of virale sequenties bevat. Zolang het niet de bedoeling is om dergelijke producten tot expressie te laten komen of te verrijken kan er bij de inschaling vanuit gegaan worden dat er geen schadelijke genproducten aanwezig zijn.

  • zoogdier (waaronder de mens)
  • land- en tuinbouwgewassen
  • organismen van bijlage 2 lijst A1

Echter als men actief naar dit soort genen op zoek gaat, dan wel ze actief gaat verrijken, dient er bij de inschaling van uitgegaan te worden dat van deze genproducten in de context van het ggo een schadelijk effect kunnen hebben. Dit geldt evenzeer als men deze genproducten in pathogene micro-organismen (bijlage 5, artikel 5.3) of virussystemen (bijlage 5, artikel 5.4) wil gaan toepassen.

11. Animale cellen onder 5.4.1

11. De interpretatie van animale cellen onder 5.4.1

Dit inschalingsartikel is van toepassing wanneer animale cellen getransfecteerd worden met plasmide DNA. Voor toepassing van dit inschalingsartikel mogen animale cellen ruimer geïnterpreteerd worden dan enkel en alleen primaire cellen en cellijnen. Ook (delen van) organismen die onder microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd worden, kunnen met behulp van dit artikel ingeschaald worden. Tot op heden is dit inschalingsartikel van toepassing geacht op activiteiten met:

  • weefselplakjes, organen en (primaire) tumoren;
  • eicellen en embryo’s van muis, rat en kip;
  • embryo’s van Danio rerio (zebravis) en Xenopus laevis (klauwkikker);
  • volledige organismen: Caenorhabditis elegans (nematode), Haliclona oculata, Haliclona xena, Dysidae avara, Crambe crambe en Ephydatia fluviatilis (sponzen), Nematostella vectensis (zeeanemoon), Macrostomum lignano, Macrostomum hystrix, Macrostomum pusillum, Isodiametra pulchra en Schmidtea mediterranea (platwormen). Organismen die niet in deze opsomming voorkomen, zijn niet eerder beoordeeld via dit inschalingsartikel en dienen dan ook via een artikel 2.8 verzoek voorgelegd te worden.
12. Transfectie onder 5.4.1

12. Transfectie onder 5.4.1

De transfectie van cellen met virale vectoren onder 5.4.1

Artikel 5.4.1 is bedoeld om handelingen met animale cellen en plantencellen in associatie met een plasmide vector of een virale transfervector, die ook als expressievector gebruikt kan worden, in te schalen; e.g. transfectie van animale cellen en plantencellen. Artikel 5.4.1 dient NIET gebruikt te worden indien de productie van virale partikels en virale replicons beoogd wordt. Afhankelijk van de biologische inperking dient de productie van virale partikels en virale replicons ingeschaald te worden volgens artikel 5.4.2 of 5.4.3.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met behulp van een virale transfervector:
Het doel is de expressie van het transgen (eiwit en/of RNA) en NIET de productie van virale partikels of virale replicons. De helper/packaging plasmiden, benodigd voor de productie van virale partikels, worden dan ook niet samen met de virale transfervector getransfecteerd. Wel dient er rekening gehouden te worden met virale sequenties aanwezig in de gastheer en de vector waardoor er mogelijk genetisch gemodificeerd virus kan ontstaan.

Transfectie van cellen met lentivirale transfervector:
Indien de cellen vrij zijn van HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere niet-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.h op ML-II-k (PG3, er kan geen genetisch gemodificeerd autonoom replicerend lentivirus geproduceerd worden). Via een artikel 2.8 verzoek kan verzocht worden om inschaling op ML-I inperkingsniveau.
Indien de cellen potentieel geïnfecteerd zijn met HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere non-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.g op ML-III (PG3, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent lentivirus kan niet uitgesloten worden).

Transfectie van cellen met muizenretrovirale transfervector:
Inschaling via 5.4.1.g op ML-II-k (PG2, een substantieel deel van de cellijnen die voor wetenschappelijk onderzoek worden gebruikt bevatten retrovirussequenties (CGM/131002-01, CGM/131220-01 en CGM/140228-01), hierdoor kan het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent retrovirus niet worden uitgesloten).
Transfectie van retrovirale transfervectoren gebaseerd op de muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen dl587 rev, Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Murine embryonic stem cell virus (MESV), Murine leukemia virus (MLV), Murine stem cell virus (MSCV), Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en Spleen focus forming virus (SFFV) mag via 5.4.1.g op ML-II-k worden ingeschaald.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met een plasmide dat virale sequenties bevat die coderen voor een enkel viraal genproduct of regulatoire sequentie*:
De cellen in dit voorbeeld zijn vrij van virale sequenties, waardoor er géén al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd kan worden.

Transfectie van cellen met een plasmide dat het GFP gen tot expressie brengt onder controle van een CMV promoter:
Inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd worden en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke sequentie aanwezig).

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als defect, voor eukaryote cellen infectieus virus via 5.4.3 ingeschaald te worden.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie. De productie van virale partikels en virale replicons wordt niet beoogd, maar het ontstaan van genetisch gemodificeerd virus kan niet worden uitgesloten als gevolg van de in de cellen aanwezige virale sequenties.

De cellijn COS-7 bevat een onvoldoende gekarakteriseerde hoeveelheid SV40 sequenties en de vorming van genetisch gemodificeerd SV40 kan niet worden uitgesloten wanneer transfecties met plasmiden met een SV40 origin of replication worden toegepast.

· Transfectie van COS-7 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.g op ML-II-k (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent SV40 kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van COS-1 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (PG2, het ontstaan van defect genetisch gemodificeerd SV40 kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van HEK293 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van (potentieel) EBV positieve cellen:

  • plasmide met EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.g op ML-II-k (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent EBV kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd EBV geproduceerd worden).

NB: Indien in de vector een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct dan kan een hogere inschaling van toepassing zijn (inschaling volgens 5.4.1.f).

13. Endogeen virus onder 5.4.1

13. Endogeen virus onder 5.4.1

Een endogeen virus dat mogelijk aanwezig kan zijn in de gastheercel of -cellijn onder 5.4.1

Bij handelingen met animale en humane cellen en cellijnen in associatie met plasmide vectoren of een virale transfervector dient, naast met de vector en de donorsequentie, rekening te worden gehouden met (de mogelijke) aanwezigheid van (wildtype) virussen en virale sequenties die bij de vervaardiging van de cellijn zijn toegepast of die als besmetting in de cellen aanwezig kunnen zijn. Er dient in de risicoanalyse rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van recombinatie en/of complementatie met deze wildtype virussen en/of virale sequenties, waardoor er een recombinant virus kan ontstaan. Op grond van artikel 5.4.1.g leidt dit tot een hogere inschaling en kunnen, afhankelijk van de eigenschappen van het virus, additionele voorschriften op het hogere inperkingsniveau van toepassing zijn.

Voorbeelden: (zie ook CGM/131002-01):

  • Geïmmortaliseerde cellijnen die het Epstein-Barr Virus (EBV) of Simian virus 40 (SV40) bevatten. Bij transfectie van dergelijke cellen (bv. RAJI en COS-7) met plasmiden die respectievelijk een EBV-ori of een SV40-ori bevatten leidt dit tot een ML-II-k inschaling.
  • Cellen kunnen ook geïmmortaliseerd zijn met delen van virussen, zoals het SV40 large T antigen, de adenovirus E1A sequentie of de Humaan papillomavirus (HPV) Type 16 E6/E7 sequentie, waarvan de aanwezigheid op zich niet tot de vorming van (recombinant) virus kan leiden. Bij transfectie van dergelijke cellen met plasmiden die HPV, SV40 of adenovirale sequenties bevatten leidt dit tot een ML-II-k inschaling, indien door de combinatie van de in de cel en het plasmide aanwezige sequenties een recombinant virus kan ontstaan.
  • Humane primaire cellen, kunnen wildtype HIV, HTLV of verwante retrovirussen bevatten. Bij transfectie van bijvoorbeeld HIV positieve cellen (of humane primaire cellen waarvan de HIV status onbekend is) met lentivirale transfervectoren leidt dit tot een ML-III inschaling.

NB: Indien in de cellijn of in het plasmide een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct kan, indien deze sequentie kan worden ingebouwd in het recombinante virus, een nog hogere inschaling dan in bovenstaande voorbeelden van toepassing zijn.

Om aanwezigheid van wildtype virussen uit te sluiten kunnen cellen die potentieel met wildtype virus geïnfecteerd zijn, voorafgaand aan de werkzaamheden op de aanwezigheid hiervan worden gecontroleerd. Indien afdoende kan worden aangetoond dat de potentieel geïnfecteerde cellen die worden gehanteerd geen relevante endogene virussen bevatten, kan de aanvrager artikel 5.4.1.h of 5.4.1.i in plaats van 5.4.1.g hanteren.

14. Endogeen virus onder 5.4.2

14. Endogeen virus onder 5.4.2

Een endogeen virus dat mogelijk aanwezig kan zijn in de gastheercel of- cellijn onder 5.4.2

Bij handelingen met animale en humane cellen en cellijnen in associatie met biologisch ingeperkte virale vectoren dient, naast met de vector en de donorsequentie, rekening te worden gehouden met (mogelijke) aanwezigheid van (wildtype) virussen en virale sequenties die bij de vervaardiging van de cellijn zijn toegepast of die als besmetting in de cellen aanwezig kunnen zijn. Er dient in de risicoanalyse rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van recombinatie en/of complementatie, waardoor er een recombinant (niet-biologische ingeperkt) virus kan ontstaan, hetgeen leidt tot een hogere inschaling, (artikel 5.4.3 in plaats van artikel 5.4.2 moet in een dergelijk geval worden toegepast, vanwege de opheffing van de biologische inperking van het virus).

Om aanwezigheid van wildtype virussen uit te sluiten kunnen cellen voorafgaand aan de werkzaamheden op de aanwezigheid hiervan worden gecontroleerd.

15. Productie virale partikels

15. Productie virale partikels

Hoe dient de productie van virale partikels te worden ingeschaald?

Voor het produceren van virale partikels wordt over het algemeen gebruik gemaakt van twee methoden:

  • Cellen worden geïnfecteerd met een virus waardoor virus vermeerdering plaatsvindt.
  • Cellen worden getransfecteerd met een of meerdere plasmiden waardoor virus productie plaatsvindt.

Afhankelijk van de biologische inperking dient de productie van virale partikels en replicons ingeschaald te worden volgens artikel 5.4.2 of 5.4.3. Inschaling volgens 5.4.2 is slechts toegestaan voor een beperkte groep van biologisch ingeperkte virale systemen. Alle overige virale systemen dienen ingeschaald te worden volgens 5.4.3. De pathogeniteitsklasse van het betreffende virus kan bepaald worden aan de hand van bijlage 4, lijst 4.1 van de Regeling.

NB: Artikel 5.4.1 dient niet gebruikt te worden voor de productie van virale partikels en replicons!

Voorbeeld

  • Infectie van cellen met full-length virus van pathogeniteitsklasse 3 (PG3), bijvoorbeeld het rabies virus, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is geclassificeerd als PG3 (lijst 4.1), het systeem is niet biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Voorbeeld:

  • Transfectie van cellen met één of meerdere plasmiden ten behoeve van productie van full-length virus van PG3, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is geclassificeerd als PG3, het systeem is niet biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Transfectie van cellen met één of meerdere plasmiden ten behoeve van productie van virus replicons gebaseerd op een PG3 virus, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is gebaseerd op een virus van PG3, het systeem wordt niet gezien als biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig. Via een 2.8 verzoek kan beargumenteerd worden aangegeven waarom dit replicon systeem (de combinatie van gastheercel, virale vector en donorsequentie) als biologisch ingeperkt beschouwd kan worden en op een lager inperkingsniveau ingeschaald kan worden.

Voorbeeld:

  • Transfectie van cellen met plasmiden ten behoeve van productie van genetisch gemodificeerde 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen aanwezig is in de transfervector: inschaling via 5.4.2.i op ML-II-k. Toelichting: De virale vector is gebaseerd op een virus van PG3, het systeem is biologisch ingeperkt (staat in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Transfectie van cellen met plasmiden ten behoeve van productie van genetisch gemodificeerde lenti-X lentivirale partikels, waarbij het GFP gen aanwezig is in de transfervector: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is gebaseerd op een virus van PG3, het systeem wordt niet gezien als biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig. Via een 2.8 verzoek kan beargumenteerd worden aangegeven waarom dit lenti-X lentivirale systeem als biologisch ingeperkt beschouwd kan worden en op een lager inperkingsniveau ingeschaald kan worden.
16. Biologisch ingeperkt systeem

16. Biologisch ingeperkt systeem

Inschaling onder bijlage 5, onder 5.4.2 (biologisch ingeperkte systemen)

Biologische inperking houdt in dat het vermogen van een (micro-)organisme om te overleven en te verspreiden in de natuur beperkt is. Het organisme kan deze beperking van nature bezitten, of de beperking kan door middel van mutatie of genetische modificatie zijn bewerkstelligd. Een biologische inperking kan ertoe leiden dat een organisme in zijn oorspronkelijke niche niet kan overleven of niet kan competeren met andere organismen. In andere gevallen kan het organisme vanwege de biologische inperking slechts overleven in een zeer speciale niche die in het ontvangende milieu niet aanwezig is. Case-by-case wordt vastgesteld of een organisme of systeem een relevante biologische inperking bezit, zodat met deze inperking rekening kan worden gehouden in de inschalingsartikelen van bijlage 5.

Inschaling volgens artikel 5.4.2 is slechts toegestaan voor een beperkte groep van biologisch ingeperkte virale systemen. Het betreft de volgende systemen.

 

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 2, die beschouwd worden als klasse 1:

  1. baculovirus met p10-deletie of met polyhedrine-deletie;
  2. modified vacciniavirus Ankara (MVA) en vacciniavirus NYVAC;
  3. kanariepokkenvirus ALVAC en kippenpokkenvirus TROVAC;
  4. van Semliki-forest virus (SFV) afgeleide replicons waarbij het genetisch gemodificeerde replicon is geproduceerd met behulp van een meervoudig plasmiden systeem.

NB: uitsluitend het uit drie vectoren bestaande SFV replicon systeem bestaande uit de vector pSFV3 (bevat de niet-structurele genen van SFV) en de twee helper plasmiden, pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2, is tot nu toe als biologisch ingeperkt beoordeeld. De helper plasmiden pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2 bevatten respectievelijk de genen coderend voor het capside eiwit en de envelop eiwitten van SFV. In het capside gen is de autoprotease activiteit verwijderd door mutatie van drie nucleotiden resulterend in een serine-alanine mutatie. Overige SFV replicon systemen dienen via 5.4.3 te worden ingeschaald.

Voorbeeld:

  • Handelingen met MVA, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.i op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Handelingen met MVA, waarbij een enkel viraal gen coderend voor een (antigeen) HPV eiwit gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.h op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en de in de gastheer gebrachte virale sequentie (afkomstig van een PG2 virus) kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes).

 

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 3, die beschouwd worden als klasse 2:

  1. Influenza stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 die zijn vervaardigd middels recombinant DNA technieken;
  2. afgeleiden van deze stammen waarbij minimaal 6 genoomsegmenten afkomstig zijn van deze stammen en twee heterologe gensegmenten van andere Influenza A stammen. Daarbij geldt voor heterologe HA-coderende gensegmenten dat de aanwezigheid van een basische klievingsplaats is uitgesloten;
  3. lentivirus dat wordt vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem.

NB. Inschalingsartikel 5.4.2 mag niet worden toegepast als door de combinatie van gastheercel, virale vector en/of donorsequentie de inperking van het systeem wordt opgeheven (gecomplementeerd).

 

Toelichting inschaling 2de en 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem onder 5.4.2 en inschaling andere lentivirale systemen onder 5.4.3.

Voor de productie van de lentivirale vectoren worden de verschillende virusfuncties opgesplitst en over tenminste drie vectoren verdeeld (zie Tabel 1). Door deze opsplitsing moet de productie van replicatiecompetent lentivirus (RCL) voorkomen worden. De drie of meer vectoren zijn:

  1. de ‘transfervector’. Dit construct bevat het gewenste transgen, geflankeerd door virale LTRs. Het bevat ook het packaging signaal, zodat het transgen in de virusdeeltjes wordt ingepakt. In verschillende systemen (zie Tabel 1) is sprake van een transfervector waarbij uit de 3’LTR sequentie de promoter en enhancer sequenties zijn verwijderd resulterend in een ‘selfinactivating’ (SIN) vector.
  2. de ‘pseudotyping vector’. Dit is een expressievector voor een envelop eiwit. Meestal wordt het VSV-G gebruikt, waardoor de resulterende lentivirale vector een veel breder spectrum van doelwitcellen kan infecteren, dan HIV-1. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreken in deze constructen.
  3. het ‘packagingconstruct’. Dit plasmide (of set van plasmiden) bevat de HIV-1 eiwitten, die nodig zijn voor virusproductie. Gag en Pol zijn de minimale componenten, maar daarnaast kunnen ook regulatoire en/of accessoire eiwitten aanwezig zijn. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreekt in dit construct.

De meest toegepaste lentivirale systemen staan in onderstaande Tabel 1 vermeld met hun specifieke eigenschappen.

Tabel 1: Overzicht lentivirale systemen

 

2e generatie SIN

3e generatie SIN

Lenti-X

Translenti

 

 

 

 

 

SIN (deletie 3’LTR)

Ja

Ja

Nee

Ja

# plasmiden

3

4

6

6

# packaging plasmiden

1

2

3

3

Accesoire genen

Vif, vpr, vpu, nef

_

_

vpr

vpr

# plasmiden

met 

 

Tat aanwezig

 

 

Rev aanwezig

1

 

 

+

+

1

 

 

-

+

2

 

 

+

+

2

 

 

+

+

# recombinaties nodig voor RCL

3

4

4

4

envelop

VSV-G

VSV-G

VSV-G

VSV-G

Standaard inschaling volgens

5.4.2

5.4.2

5.4.3

5.4.3

Inperking

ML-II-k

ML-II-k

 

ML-III

ML-III

 

In de Regeling worden uitsluitend lentivirale partikels die worden vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem als biologisch ingeperkt beschouwd. De 2de en 3de generatie SIN lentivirale vectorsystemen moeten voldoen aan de definities zoals vermeld in artikel 2 van de Regeling. Uitsluitend 2de en 3de generatie SIN lentivirale vectorsystemen waarin voor de pseudotypering gebruik wordt gemaakt van een apart plasmide coderend voor het VSV-G eiwit en die voldoen aan de verdere specificaties zoals vermeld in tabel 1 worden in de Regeling als biologisch ingeperkt beschouwd en worden ingeschaald onder 5.4.2.

Lentivirale systemen die niet voldoen aan de bovenvermelde definitie van het 2de en 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem (bv. het lenti-X systeem en het translenti systeem, Tabel 1) worden onder artikel 5.4.3 ingeschaald en moeten case-by-case via een artikel 2.8 verzoek langskomen voor een eventuele lagere inschaling op basis van hun biologische inperking. Hier is voor gekozen omdat de ervaring heeft geleerd dat (combinaties van) deze systemen vaak foutief worden ingeschaald op een te laag niveau.

NB: Voor alle in de tabel vermelde systemen geldt dat indien voor de pseudotypering gebruik wordt gemaakt van het reguliere plasmide coderend voor het VSV-G eiwit (en indien verder geen heterologe virale sequenties in de transfervector aanwezig zijn) de inschaling moet plaatsvinden onder 5.4.2.i (in geval van een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal systeem) of 5.4.3.i (overige in Tabel 1 vermelde systemen). Er wordt in dit geval vanuit gegaan dat bij de productie van de partikels geen chimeer virus kan worden gevormd. 

Voorbeeld:

Inschaling 2de of 3de generatie SIN lentiviraal systeem:

Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een humane promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.i op ML-II-k. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een CMV promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.h op ML-II-k . Toelichting: het systeem gebaseerd op PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG2 virus (CMV)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

 

Inschaling lenti-X lentiviraal systeem:

Productie van lenti-X lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een humane promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van lenti-X lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een CMV promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.3.h op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (CMV promoter afkomstig van een PG2 virus) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Via een artikel 2.8 verzoek kan beargumenteerd worden aangegeven waarom de voorgaande drie voorbeelden als biologisch ingeperkt beschouwd kunnen worden en op een lager inperkingsniveau gehanteerd kunnen worden.

 

Inschaling combinatie van lentivirale systemen:

Productie van lentivirale partikels, waarbij een lenti-X transfer vector, waarin het GFP gen is gekloneerd, wordt gecombineerd met 3de generatie lentivirale packaging vectoren: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) is niet voldoende biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

 

Omgang met een aantal veelgebruikte virale sequenties:

  • Immortalisatie van cellijnen door middel van de immortaliserende virale eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T of Ad5 E1A die tot expressie worden gebracht met behulp van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels kan via artikel 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.
  • Toepassing van bepaalde veelgebruikte korte virale sequenties afkomstig van ongeclassificeerde virussen of van klasse 3 en klasse 4 virussen (uitsluitend 2A sequenties, VSV-tag, HA-tag en AU-1 tag) als donorsequentie in 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels mag via 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.
  • Productie van tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentivirale partikels, waarbij sprake is van regulatoire sequenties afkomstig van muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen (Murine leukemia virus (MLV), murine embryonic stem cell virus (MESV), Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), murine stem cell virus (MSCV), spleen focus forming virus (SFFV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en dl587 rev) in de transfervector: mag via 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.

 

Toelichting inschaling influenza A stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 onder 5.4.2 en inschaling andere influenza A stammen onder 5.4.3.

Voor ggo activiteiten worden influenza A virussen standaard ingedeeld in pathogeniteitsklasse 3. Deze classificatie houdt in dat ggo activiteiten met de meeste influenza A virussen conform bijlage 5.4.3 minimaal ingeschaald worden op ML-III. De laagpathogene geattenueerde laboratoriumstammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 vormen hierop een uitzondering, deze worden als biologisch ingeperkt beschouwd. Van beide virusstammen is bekend dat ze niet virulent en sterk geattenueerd zijn voor mensen, waardoor deze stammen conform artikel 5.4.2 kunnen worden toegepast op ML-II inperkingsniveau. Tevens worden chimere influenza virussen die zijn samengesteld uit 6 of 7 genoomsegmenten van A/PR/8/34 of A/WSN/33 en 1 of 2 heterologe genoomsegmenten (bv. HA of NA) van andere wildtype influenza A virussen afkomstig van mens of dier, met uitzondering van de 1918 virusstam, als biologisch ingeperkt beschouwd. Andere (al dan niet chimere) laagpathogene influenza A stammen worden standaard onder artikel 5.4.3 ingeschaald en moeten case-by-case via een artikel 2.8 verzoek langskomen voor een eventuele lagere inschaling.

Voorbeeld:
Productie van A/PR/8/34, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het virus achter een endogene promoter: inschaling via 5.4.2.i op ML-II-k. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) is biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van A/PR/8/34, met heterologe HA en NA genoomsegmenten van een andere influenza A virusstam: inschaling via 5.4.2.h op ML-II-k (het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) is biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG3 virus (influenza A)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Productie van een vaccinstam gebaseerd op 6 gen segmenten van een influenza A stam niet vermeld onder 5.4.2, met heterologe HA en NA genoomsegmenten van een andere influenza A virusstam: inschaling via 5.4.3.h op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG3 virus (influenza A)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Via een artikel 2.8 verzoek kan eventueel beargumenteerd worden waarom de stam als biologisch ingeperkt beschouwd kan worden en op een lager inperkingsniveau gehanteerd kan worden.

17. 5.4.3.b en 5.4.3.g

17. 5.4.3.b en 5.4.3.g

5.4.3.b en 5.4.3.g: virale vectoren die als donorsequentie een voor eukaryote cellen infectieus virus bevatten

Het gaat bij 5.4.3.b en 5.4.3.g om niet-biologisch ingeperkte virale vectoren van klasse 4, 3 of 2. Daarbij zijn in deze vectoren (als donorsequentie) sequenties van een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk klasse 4, 3 of 2 toegepast en deze donorsequenties kunnen zelf ook leiden tot de vorming van autonoom replicerende deeltjes. Er zijn dus twee soorten replicerende virusdeeltjes aanwezig.

Voor deze activiteiten geldt altijd een vergunningprocedure.

Voorbeeld:
een vacciniavirus vector (PG2 humaan pathogeen) waarin een compleet genoom van een sindbisvirus (PG2 humaan pathogeen) is gekloneerd, waardoor naast nieuwe vacciniavirusdeeltjes (met het sindbisgenoom) ook autonoom replicerende sindbisvirusdeeltjes gevormd kunnen worden: inschaling 5.4.3.g op ML-II-v.
een myxomavirus vector (PG2 strikt dierpathogeen) waarin een compleet genoom van Infectious bronchitis virus (IBV) (PG2 en strikt dierpathogeen) is gekloneerd, waardoor naast nieuwe myxomavirusdeeltjes (met het IBV genoom) ook autonoom replicerende IBV deeltjes gevormd kunnen worden: inschaling via 5.4.3.g op ML-II-v.

18. Chimere virussen

18. Chimere virussen

Wanneer is sprake van een chimeer virus?

Van een chimeer virus is sprake bij uitwisseling of toevoeging van functionele sequenties op genomisch niveau, zoals (delen van) genen of (delen van) regulatoire virale sequenties van één virusstam met de ‘backbone’ van een andere virusstam. Een voorbeeld van een chimeer virus is een humaan coronavirus van stam X waarbij uitwisseling van structurele of niet-structurele genen met een dierlijk coronavirus Y heeft plaatsgevonden dat moet worden ingeschaald op ML-II-v volgens 5.4.3.h. Maar bijvoorbeeld een adenovirus waarin een regulatoire sequentie van een ander virus is gekloneerd (bv. de CMV promoter) wordt in de Regeling ook gezien als een chimeer virus, maar dat kan volgens 5.4.3.h ingeschaald worden op ML-II-k.

19. Bij 5.4.3.c en 5.4.3.h

19. Bij 5.4.3.c en 5.4.3.h

Bij 5.4.3.c en 5.4.3.h: virale vectoren die als donorsequentie een of meer virale sequenties bevatten die niet coderen voor een voor eukaryote cellen infectieus virus

Het gaat bij 5.4.3.c en 5.4.3.h om niet-biologisch ingeperkte virale vectoren van klasse 4, 3 of 2 waarbij in deze vectoren (als donorsequentie) één of meerdere sequenties van een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk klasse 4, 3 of 2 zijn toegepast. Daarbij geldt dat deze donorsequenties zelf niet kunnen leiden tot de vorming van autonoom replicerende deeltjes (in tegenstelling tot 5.4.3.b en 5.4.3.g). Door de aanwezigheid van de donorsequentie is echter sprake van een chimeer virus.

Voor virale vectoren van klasse 3 en 4 geldt (ongeacht de donorsequentie) altijd een vergunningprocedure.

De te volgen procedure voor een virale vector van klasse 2 is in de meeste gevallen II-k.

Voor chimeren van een aantal virussen van klasse 2 geldt echter een II-v procedure:

  • De virale vector is een virus van klasse 2 en betreft Enterovirus C poliovirus type 1, 2 of 3 of Enterovirus C coxsackievirus type A1, A11, A13, A17, A19 tot en met A22, A24 en de donorsequentie is afkomstig van Enterovirus C poliovirus type 1, 2 of 3 of Enterovirus C coxsackievirus type A1, A11, A13, A17, A19 tot en met A22, A24;
  • De virale vector is een virus van klasse 2 en betreft humaan Parechovirus type 1, 2, 3, 4 of 5 en de donorsequentie is afkomstig van humaan Parechovirus type 1, 2, 3, 4 of 5;
  • De virale vector betreft een virus uit de familie Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, of Togaviridae en de donorsequentie is afkomstig van een virus uit dezelfde familie als de virale vector.

Voorbeeld:

  • Adenovirus serotype 5 virus (PG2 humaan pathogeen) waarbij uitwisseling met het fiber eiwit van een ander Adenovirus serotype heeft plaatsgevonden (virale sequentie afkomstig van PG2 humaan pathogeen): inschaling via 5.4.3.h op ML-II-k. Adenovirus serotype 5 virus (PG2 humaan pathogeen) waarin een CMV promoter (virale sequentie afkomstig van PG2 humaan pathogeen) is gekloneerd voor de expressie van GFP: inschaling via 5.4.3.h op ML-II-k.
  • Muizen gammaretrovirus (PG2 strikt dierpathogeen) waarin een CMV promoter (virale sequentie uit een humaan PG2 virus) is gekloneerd voor de expressie van GFP: inschaling via 5.4.3.h op ML-II-k.
  • Bovine viral diarrhea virus type 1 waarbij sequenties worden uitgewisseld met sequenties van Bovine viral diarrhea virus type 2: inschaling via 5.4.3.h op ML-II-v. Toelichting: het betreft uitwisseling van sequenties tussen flavivirussen van PG2.
20. 5.4.3.h: geen effect ds

20. 5.4.3.h: geen effect ds

Omgang met een aantal veelgebruikte virale sequenties onder 5.4.3.h

  • Immortalisatie van cellijnen door middel van de immortaliserende virale eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T of Ad5 E1A die tot expressie worden gebracht met behulp van de bekende meervoudige plasmiden systemen gebaseerd op muizenretrovirussen, AAV of humaan adenovirus (klasse 2) kan via artikel 5.4.3.h op ML-II-k worden ingeschaald.
  • Toepassing van bepaalde veelgebruikte korte virale sequenties afkomstig van ongeclassificeerde virussen of van klasse 3 en klasse 4 virussen (uitsluitend 2A sequenties, VSV-tag, HA-tag en AU1-tag) als donorsequentie in een klasse 2 virus mag via 5.4.3.h op ML-II-k worden ingeschaald.
21. Retroviraal vectorsysteem

21. Retroviraal vectorsysteem

Retrovirale vectorsystemen onder 5.4.3

Het betreft hier uitsluitend retrovirale vectoren welke vervaardigd zijn met een retroviraal vectorsysteem dat gebaseerd is op de muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide virussen zoals:

  • dl587 rev, Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Murine embryonic stem cell virus (MESV), Murine leukemia virus (MLV), Murine stem cell virus (MSCV), Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV), Spleen focus forming virus (SFFV).

Met een retroviraal vectorsysteem wordt een productiesysteem voor retrovirale vectoren bedoeld; bijvoorbeeld de productie van amphotroop retrovirus door transfectie van de phoenix-Ampho cellijn met de plasmide pLXSN. Bij deze systemen bevat slechts het plasmide met het transgen (de transfervector) het packagingsignaal. De genen gag, pol en env zijn afwezig op de transfervector en worden in trans aangeboden via een of meerdere plasmiden waarvan het packagingsignaal ontbreekt. Veelal wordt gebruik gemaakt van stabiele cellijnen die de genen gag, pol en env tot expressie brengen.

Het gaat hierbij nadrukkelijk niet om handelingen (productie en/of infectie) met de volledige virussen zoals hierboven genoemd. Werkzaamheden met bijvoorbeeld full length MPSV (niet-geclassificeerd) dienen dan ook niet via dit inschalingsartikel ingeschaald te worden, maar dienen via een 2.8 verzoek aangevraagd te worden.

22. 5.4.4

22. 5.4.4

Activiteiten met al dan niet genetisch gemodificeerde animale cellen dan wel plantencellen al dan niet in associatie met een genetisch gemodificeerd micro-organismen (5.4.4)

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.b en 5.4.4.c?

Onder onderdeel b betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een dier afkomstige cellen. Het dier is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een dier (veelal afkomstig van ongemodificeerde dieren of genetische gemodificeerde ‘transgene’ dieren die op D-I inperkingsniveau worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

NB: Voor toepassing van het inschalingsartikel 5.4.4.b mogen animale cellen ruimer geïnterpreteerd worden dan enkel en alleen primaire cellen en cellijnen. Ook (delen van) organismen die onder microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd worden, kunnen met behulp van dit artikel ingeschaald worden (zie ook toelichting onder 10).

Onder onderdeel c betreft het cellen afkomstig van dieren die in vivo aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is het DM-niveau waarop de dieren zijn ingeschaald (zie bijlage 5.6) leidend voor de inschaling van de uit deze dieren afkomstige cellen op ML niveau. Hierbij dient er rekening te worden gehouden dat handelingen met dieren in associatie met micro-organismen die op ML-II niveau moeten worden gehanteerd, in geval van aërogene verspreiding van het micro-organisme (bv. bij toepassing van genetisch gemodificeerde  adenovirussen) of waarbij een eventuele biologische inperking van het micro-organisme door het dier gecomplementeerd zou kunnen worden, conform 5.6.2.c op DM-III niveau kunnen zijn ingeschaald. Voor cellen afkomstig uit deze dieren geldt dus op grond van 5.4.4.c een ML-III inschaling.

De gebruiker kan een artikel 2.8 verzoek doen om met deze op ML-III niveau ingeschaalde cellen te mogen werken op ML-II niveau. Bij dit verzoek dient bijvoorbeeld te worden onderbouwd hoe kruiscontaminatie met klasse 3 genetische gemodificeerde organismen en complementatie (bij biologisch ingeperkte organismen) op DM-III inperkingsniveau zijn voorkomen.

 

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.e en 5.4.4.f?

Onder onderdeel e betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een plant afkomstige cellen. De plant is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een plant (veelal afkomstig van wildtype planten of planten die op PL-I, PC-I, PKa-I of PKb-I worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden, zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

Onder onderdeel f betreft het cellen afkomstig van planten die aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is het inperkingsniveau waarop de planten zijn ingeschaald (zie bijlage 5.5.3) leidend voor de inschaling van de uit deze planten afkomstige cellen op ML niveau.

Hierbij dient er rekening te worden gehouden dat handelingen met planten in associatie met micro-organismen die op ML-II niveau moeten worden gehanteerd in geval van aërogene verspreiding van het micro-organisme (bv. het geval bij toepassing van sporulerende schimmels), conform 5.5.3.c op PCM-III/PKM-III kunnen zijn ingeschaald. Voor cellen afkomstig uit deze planten geldt dus op grond van 5.4.4.f een ML-III inschaling.

De gebruiker kan een artikel 2.8 verzoek doen om met deze op ML-III niveau ingeschaalde cellen te mogen werken op ML-II niveau. Bij dit verzoek dient bijvoorbeeld te worden onderbouwd hoe kruiscontaminatie met klasse 3 genetische gemodificeerde organismen op PCM-III/PKM-III inperkingsniveau is voorkomen.

23. Gesloten eenheden

23. Gesloten eenheden

Handelingen in gesloten eenheden

Bij handelingen in gesloten eenheden is er sprake van inperking bij de bron, dus op organisme niveau. De volgende voorbeelden illustreren wat ermee bedoeld wordt:

  • Een gg micro-organisme in medium in een gesloten kweekbuis dat wordt geïncubeerd in een stoof in AP-I. In dit geval kunnen er geen aërosolen, waarin zich mogelijk ggo’s bevinden, ontstaan en ontsnappen.
  • Voor microscopie op AP-I geldt dat bij monsters op een objectglas het dekglaasje dichtgeseald moet zijn.
  • Een gg dier bevindt zich in een gesloten box of wordt tijdens een experiment tevoren genarcotiseerd in D-I en blijft gedurende de meting onder narcose zodat het niet kan ontsnappen. 
24. Cellen die tot dier leiden

24. Cellen die tot dier leiden

Handelingen met animale cellen (ES-cellen/bevruchte oöcyten) die tot dieren leiden

Handelingen met animale cellen op ML-I niveau waarbij homologe recombinatie in ES-cellen wordt toegepast of micro-injectie van DNA in bevruchte oöcyten, leiden in de meeste gevallen tot dieren die op D-I moeten worden gehuisvest (bijlage 5.6). Dieren die vervaardigd zijn met plasmiden waarin virale sequenties of transposons aanwezig zijn, worden mogelijk hoger ingeschaald. Alleen voor de diersoorten genoemd in artikel 5.6.1.a is de manier van huisvesten van de dieren vastgesteld. Voor alle andere genetisch gemodificeerde dieren moet de manier van huisvesten via een artikel 2.8 verzoek voorgelegd worden aan Bureau GGO.

25. Opsomming diersoorten

25. Opsomming diersoorten

Uitsluitend de in dit inschalingsartikel beschreven diersoorten kunnen via dit inschalingsartikel ingeschaald worden en alleen voor deze dieren is de manier van huisvesten bepaald. Experimenten met andere diersoorten moeten worden voorgelegd via een artikel 2.8 verzoek.

26. Filtertopkooien en isolator

26. Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien worden voorgeschreven voor de huisvesting van kleine proefdieren (zoals muizen, ratten en cavia’s) in associatie met genetisch gemodificeerde micro-organismen. Kleine proefdieren en sommige grotere proefdieren (zoals fretten) kunnen ook worden gehuisvest in isolatoren. In de praktijk gaat het hier meestal om ggo’s die voor laboratoriumwerkzaamheden zijn ingeschaald op ten hoogste ML-II niveau, die zich aërogeen kunnen verspreiden (zoals adenovirus) of die serieuze ziekteverschijnselen kunnen veroorzaken, waardoor additionele inperking nodig is om verspreiding naar mens en milieu te beperken of te voorkomen. Het concept dat hierbij gehanteerd wordt, is dat elke kooi of isolator een microbiologische eenheid voorstelt die onafhankelijk is van alle andere kooien of isolatoren in de ruimte. Dit betekent feitelijk dat de microbiële inperking plaats vindt op het niveau van de kooi of de isolator en niet op het niveau van de ruimte. De inschaling van de dierexperimenten waarbij ggo’s van klasse 2 worden toegepast zal doorgaans op DM-II plaatsvinden waarbij een filtertopkooi of een isolator wordt voorgeschreven. Voor grotere proefdieren zal het gebruik van filtertopkooien of isolatoren geen optie meer zijn omdat de dieren er niet passend en veilig in gehuisvest kunnen worden. De inschaling van exprimenten met aërogeen verspreidende ggo’s in dergelijke grote proefdieren zal DM-III zijn; hierbij vindt de inperking ten aanzien van het milieu dus plaats op het niveau van de ruimte (e.g. onderdruk en HEPA filter) en worden ten aanzien van de medewerkerbescherming persoonlijke beschermingsmiddelen voorgeschreven.
 

27. Handelingen gg-Drosophila

27. Handelingen gg-Drosophila

De COGEM heeft eerder geadviseerd over werkzaamheden met genetisch gemodificeerde Drosophila melanogaster (CGM/001016-01 en CGM/050215-04). Het overzetten van gg-Drosophila melanogaster stocks valt niet onder het aanvullend voorschrift voor open handelingen zoals bedoeld in deze eerdere COGEM adviezen. Het aanvullend voorschrift dat de gg-vliegen geïmmobiliseerd dienen te worden met behulp van afkoeling of met behulp van CO2 verdoving, betreft open handelingen waarbij er experimenten met de gg-insecten plaatsvindt buiten de kweekcontainers. Bij het overzetten vinden er echter geen experimentele handelingen plaats, slechts het overbrengen van de vliegenstock van de ene naar de andere voedingsbuis. Het overzetten gebeurt snel, binnen enkele seconden, waardoor er nauwelijks ontsnapping plaatsvindt. Deze kortstondige handelingen kunnen als standaard handelingen worden beschouwd.